2 × Пфу ПЦР мешавина

А-1 Темплате

■ Шаблон садржи протеинске нечистоће или инхибиторе Так, итд. - Очистите шаблон ДНК, уклоните протеинске нечистоће или екстрахујте шаблон ДНК комплетима за пречишћавање.

■ Денатурација шаблона није потпуна —— Одговарајуће повећати температуру денатурације и продужити време денатурације.

■ Деградација шаблона ——Поново припремите шаблон.

А-2 Пример

■ Лош квалитет прајмера —— Поново синтетизујте прајмер.

■ Разградња прајмера —— Поделите прајмере велике концентрације у мале запремине ради очувања. Избегавајте вишеструко замрзавање и одмрзавање или дуготрајно криоконзервирање на 4 ° Ц.

■ Неправилно обликовање прајмера (нпр. Дужина прајмера није довољна, димер формиран између прајмера итд.) -Преизмењавање прајмера (избегавање стварања димера прајмера и секундарне структуре)

А-3 мг²⁺концентрација

■ Мг²⁺ концентрација је прениска —— Правилно повећајте Мг²⁺ концентрација: Оптимизовати Мг²⁺ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг²⁺ концентрација за сваки шаблон и прајмер.

А-4 Температура жарења

■ Висока температура жарења утиче на везивање прајмера и шаблона. ——Смањите температуру жарења и оптимизујте стање са градијентом од 2 ° Ц.

А-5 Време продужења

■ Кратко време продужења —— Продужите време продужења.

Феномени: Негативни узорци такође показују траке циљних секвенци.

А-1 Контаминација ПЦР-ом

■ Укрштена контаминација циљне секвенце или продуката амплификације —— Пажљиво да се у негативном узорку не пипетира узорак који садржи циљну секвенцу или да се излије из епрувете за центрифугу. Реагенсе или опрему треба аутоклавирати како би се елиминисале постојеће нуклеинске киселине, а постојање контаминације треба утврдити експериментима са негативном контролом.

■ Контаминација реагенса —— Поразделите реагенсе и чувајте на ниској температури.

А-2 Примеr

■ Мг²⁺ концентрација је прениска —— Правилно повећајте Мг²⁺ концентрација: Оптимизовати Мг²⁺ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг²⁺ концентрација за сваки шаблон и прајмер.

■ Неправилан дизајн прајмера, а циљна секвенца има хомологију са секвенцом без циља. —— Прајмери ​​за поновно дизајнирање.

Феномени: ПЦР појачавачке траке нису у складу са очекиваном величином, велике или мале, или се понекад јављају и специфичне појачане појасеве и неспецифичне појачане појасеве.

А-1 Пример

■ Лоша специфичност прајмера

—— Прајмер за редизајн.

■ Концентрација прајмера је превисока —— Правилно повећајте температуру денатурације и продужите време денатурације.

А-2 мг²⁺ концентрација

■ Мг²⁺ концентрација је превисока —— Правилно смањите концентрацију Мг2+: Оптимизујте Мг²⁺ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг²⁺ концентрација за сваки шаблон и прајмер.

А-3 Термостабилна полимераза

■ Превелика количина ензима —— Смањите количину ензима на одговарајући начин у интервалима од 0,5 У.

А-4 Температура жарења

■ Температура жарења је прениска —— Одговарајуће повећајте температуру жарења или усвојите двостепену методу жарења

А-5 ПЦР циклуси

■ Превише циклуса ПЦР -а - Смањите број циклуса ПЦР -а.

А-1 Пример—— Лоша специфичност ——Пројектирајте прајмер, промените положај и дужину прајмера како бисте побољшали његову специфичност; или извршите угнежђену ПЦР.

А-2 ДНК шаблона

—— Шаблон није чист—— Очистите шаблон или извуците ДНК сетовима за пречишћавање.

А-3 мг²⁺ концентрација

——Мг²⁺ концентрација је превисока —— Правилно смањити Мг²⁺ концентрација: Оптимизовати Мг²⁺ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг²⁺ концентрација за сваки шаблон и прајмер.

А-4 дНТП

—— Концентрација дНТП -а је превисока —— Смањите концентрацију дНТП -а на одговарајући начин

А-5 Температура жарења

—— Прениска температура жарења —— Одговарајуће повећати температуру жарења

Циклуси А-6

—— Превише циклуса ——Оптимизујте број циклуса

Први корак је одабир одговарајуће полимеразе. Обична Так полимераза не може се лекторисати због недостатка 3'-5 'егзонуклеазне активности, а неусклађеност ће у великој мери смањити ефикасност продужења фрагмената. Због тога обична Так полимераза не може ефикасно појачати циљне фрагменте веће од 5 кб. Так полимеразу са посебном модификацијом или другу полимеразу високе верности треба изабрати како би се побољшала ефикасност продужења и задовољиле потребе појачања дугих фрагмената. Осим тога, појачавање дугих фрагмената такође захтева одговарајуће прилагођавање дизајна прајмера, време денатурације, време продужења, пХ пуфера итд. Обично прајмери ​​са 18-24 бп могу довести до бољег приноса. Да би се спречило оштећење шаблона, време денатурације на 94 ° Ц треба смањити на 30 секунди или мање по циклусу, а време за повећање температуре на 94 ° Ц пре појачања треба да буде мање од 1 минута. Штавише, подешавање температуре продужења на око 68 ° Ц и пројектовање времена продужења према брзини од 1 кб/мин може обезбедити ефикасно појачавање дугих фрагмената.

Стопа грешака у амплификацији ПЦР -а може се смањити употребом различитих ДНК полимераза високе верности. Међу свим до сада пронађеним Так ДНК полимеразама, Пфу ензим има најмању стопу грешака и највећу верност (види приложену табелу). Поред селекције ензима, истраживачи могу додатно смањити стопу мутације ПЦР -а оптимизацијом реакционих услова, укључујући оптимизацију састава пуфера, концентрацију термостабилне полимеразе и оптимизацију броја циклуса ПЦР -а.