ФастКинг РТ-ПЦР комплет у једном кораку

А-1 РНК је разграђена

—— Очистите висококвалитетну РНК без контаминације. Материјал из кога се екстрахује РНК треба да буде што је могуће свежији како би се спречила деградација РНК. Анализирајте интегритет РНК на денатурисаном гелу пре РТ реакције. Након екстракције РНК, треба је складиштити у 100% формамиду. Ако се користи инхибитор РНазе, температура загревања треба да буде <45 ° Ц, а пХ мањи од 8,0, у супротном ће инхибитор ослободити сву везану РНазу. Штавише, инхибитор РНазе треба додати у растворима који садрже ≥ 0,8 мМ ДТТ.

А-2 РНК садржи инхибиторе реакција обрнуте транскрипције

—— Инхибитори обрнуте транскрипције укључују СДС, ЕДТА, глицерол, натријум пирофосфат, спермидин, формамид, гванидинску со итд. Помешајте контролну РНК са узорком и упоредите принос са реакцијом контролне РНК да бисте проверили да ли постоји инхибитор. Оперите таложење РНА са 70% (в/в) етанола да бисте уклонили инхибиторе.

А-3 Недовољно жарење прајмера који се користи за синтезу првог ланца цДНК

—— Утврдите да је температура жарења погодна за прајмере кориштене у експерименту. За случајне хексамере препоручује се одржавање температуре на 25 ° Ц 10 минута пре него што се достигне температура реакције. За прајмере специфичне за ген (ГСП), испробајте други ГСП или пређите на олиго (дТ) или насумични хексамер.

А-4 Мала количина почетне РНК

——Повећајте количину РНК. За узорке РНК мање од 50 нг, 0,1 μг до 0,5 μг ацетил БСА се може користити у синтези цДНК првог ланца

А-5 Циљана секвенца није изражена у анализираним ткивима.

—— Пробајте друга ткива.

А-6 ПЦР реакција не успева

——За двостепену РТ-ПЦР, цДНА шаблон у кораку ПЦР не може премашити 1/5 реакционе запремине.

А-1 Неспецифично жарење прајмера и шаблона

—— 3'-крај прајмера не би требао садржавати 2-3 дГ или дЦ. У синтези првог ланца користите прајмере специфичне за ген уместо насумичних прајмера или олиго (дТ). У првих неколико циклуса користите вишу температуру жарења, а затим нижу температуру жарења. Користите Так ДНК полимеразу са стартом за ПЦР да бисте побољшали специфичност реакције.

А-2 Лош дизајн гена специфичних прајмера

—— Следите исте принципе за дизајн прајмера за појачање.

А-3 РНК контаминирана геномском ДНК

—— Третирајте РНК са ДНазом разреда ПЦР. Поставите контролну реакцију без обрнуте транскрипције да бисте открили контаминацију ДНК.

А-4 Формирање прајмерног димера

—— Дизајнирајте прајмере без комплементарних секвенци на крају 3 '.

А-5 Превисока Мг²⁺ концентрација

——Оптимизујте Мг²⁺ концентрација за сваку комбинацију шаблона и прајмера

А-6 Загађен страном ДНК

—— Користите врхове отпорне на аеросол и ензиме УДГ.

А-1 Садржај производа прве нити је превисок

—— Смањите количину производа прве нити у конвенционалном кораку ПЦР реакције.

А-2 Превелика количина прајмера у ПЦР реакцији

——Смањи унос прајмера.

А-3 Превише циклуса

——Оптимизујте услове ПЦР реакције и смањите број циклуса ПЦР.

А-4 Прениска температура жарења

——Повећајте температуру жарења како бисте спријечили неспецифично покретање и продужење.

А-5 Неспецифична амплификација фрагмената олигонуклеотида насталих разградњом ДНазе ДНК-Издвојите висококвалитетну РНК да бисте спречили контаминацију ДНК.

РТ-ПЦР треба да обрнуто транскрибује РНК у цДНК, а затим да користи реверзно транскрибовану цДНК као шаблон за ПЦР реакцију за амплификацију циљног фрагмента. Одаберите случајне прајмере, Олиго дТ и прајмере специфичне за ген према специфичним условима експеримента. Сви горе наведени прајмери ​​могу се користити за кратку еРК ћелијску мРНК без структуре укоснице.

Случајни прајмер: Погодан за дугу РНК са структуром укоснице, као и за све врсте РНК као што су рРНК, мРНК, тРНК итд. Углавном се користе за РТ-ПЦР реакцију појединачног шаблона.

Олиго дТ: Погодно за РНК са ПолиА репом (прокариотска РНК, еукариотска Олиго дТ рРНА и тРНА немају ПолиА репове). Будући да је Олиго дТ везан за ПолиА реп, квалитет узорака РНК мора бити висок, па чак и мала количина разградње у великој мери ће смањити количину синтезе цДНА пуне дужине.

Генски специфичан прајмер: Комплементаран са шаблоном секвенце, погодан за ситуације у којима је позната циљна секвенца.

Постоје два начина:

1. Интерна референтна метода: У теорији, цДНК су фрагменти ДНК различите дужине, па је резултат електрофорезе брис. Ако је бројност РНК мала, ниједан производ се неће показати у електрофорези, али то не значи да ниједан производ неће бити појачан ПЦР -ом. Уопштено, интерна референца се може користити за откривање цДНК. Ако интерна референца даје резултате, у основи се може гарантовати квалитет цДНК (у неколико случајева, ако је фрагмент циљног гена предуг, могу постојати изузеци).

2. Ако постоји познати ген појачан овим шаблоном, то се може проверити прајмерима овог гена. Појачавање интерне референце не значи нужно да нема проблема са цДНА. Пошто интерна референца има велику количину цДНК, лако ју је појачати. Ако се цДНА делимично разгради из различитих разлога, из перспективе вероватноће, резултати ПЦР -а циљаних гена мале изобилности биће у великој мери погођени. Иако је интерних референци још увек у изобиљу, појачање вероватно неће бити погођено.

Делимична деградација РНК. Откријте интегритет и пречистите РНК

Садржај РНК различитих врста може бити различит, али генерално, екстрахована укупна РНК треба да садржи две јасне траке 28С и 18С у електрофорези у гелу, а светлина прве траке треба да буде двоструко већа од оне друге. Трака 5С указује на то да је РНК деградирана, а њена светлина је пропорционална степену разградње. Успешно појачавање интерне референце не значи да нема проблема са РНК, јер је интерна референца у великом броју, РНК се може појачати све док разградња није озбиљна. ОД₂₆₀/ОД₂₈₀Однос чисте РНК мерен спектрофотометром треба да буде између 1,9 и 2,1. Мала количина нечистоће протеина у РНК ће смањити однос. Све док вредност није прениска, то неће утицати на РТ. Оно што је најважније за РТ је интегритет РНК.

Продужетак интерног референтног гена може само указивати на то да је РТ успео, али то није нужно повезано са квалитетом ланца цДНА. Будући да су интерни референтни фрагменти генерално мале величине и високог израза, лакше је постићи успех у обрнутој транскрипцији. Међутим, величина и експресија циљног гена варирају од гена до гена. Квалитет цДНК не може се проценити само интерном референцом, посебно за циљне фрагменте дуже од 2 кб.

Неки узорци имају сложене секундарне структуре, или имају богат садржај ГЦ -а, или су драгоцени са малом количином. У тим случајевима, одговарајућу реверзну транскриптазу треба изабрати према величини циљног фрагмента и узорка. За шаблоне РНК са високим садржајем ГЦ и сложеном секундарном структуром, тешко је отворити секундарну структуру на ниској температури или са уобичајеном реверзном транскриптазом. За ове шаблоне може се изабрати Куант Реверсе Трансцриптасе, будући да су њене перформансе обрнуте транскрипције очигледно боље од оне реверзне транскриптазе серије М-МЛВ, која може ефикасно преокренути различите РНА шаблоне и максимално транскрибовати РНК у први ланац цДНК. Када се користи општи комплет реверзне транскриптазе, систем од 20 μл може ефикасно да преокрене само 1 μг укупне РНК. Молимо обратите пажњу на максимални РТ капацитет комплета. Ако се шаблон дода у вишку, реверзна транскрипција ће фаворизовати РНК са великом количином. Због тога је боље не прелазити максимални капацитет система.

А-1 Утврдити да ли је РНК озбиљно разграђена и да ли је РТ успешан

Генерално, разлог неуспеха интерног референтног појачања често је узрокован озбиљном деградацијом РНК. Други могући разлог је грешка обрнуте транскрипције. Интерна референца не може се користити као стандард за процену квалитета једноструког ланца цДНА, али се може користити као стандард за процену да ли је реверзна транскрипција успешна ако нема проблема са квалитетом РНК. Најважнија ствар у процесу обрнуте транскрипције је одржавање константне температуре и константног реакционог система како би се побољшала ефикасност реакције.

А-2 Утврдити да ли су прајмери ​​за амплификацију интерних референтних гена поуздани и да ли има проблема са реагенсима који се користе у ПЦР-у.

За релативну квантификацију, РНК се мора квантификовати пре обрнуте транскрипције, што је такође потребно у многим комплетима за обрнуту транскрипцију, на пример, квантификовати унос РНК као 1 μг. Пошто је обрнуто транскрибована цДНК мешани раствор, укључујући РНК, олиго дТ, ензим, дНТП, па чак и мало ДНК остатка, доћи ће до одступања, па је немогуће прецизно квантификовати цДНК. Због тога је неопходна квантификација РНК. С обзиром на то да је ефикасност обрнуте транскрипције иста међу различитим узорцима, количина добијене цДНК треба да буде иста, а квантитативна анализа може показати упоређивање нивоа експресије различитих гена у истој количини укупне РНК. Приликом извођења релативне флуоресцентне квантитативне ПЦР, квантитативна цДНК можда неће бити потребна након обрнуте транскрипције јер се унутрашњи референтни ген може понашати као референца.

Углавном се односи на гене, и обрнута транскрипција дугог фрагмента није изводљива за већину гена. Прво, ефикасност обрнуте транскрипције је далеко нижа од ПЦР. Друго, регија богата ГЦ -ом и секундарна структура многих гена ограничавају и обрнуту транскрипцију и ПЦР. Коначно, верност и ефикасност амплификације ПЦР -а је тешко гарантовати у исто време. У процесу обрнуте транскрипције, нико не може гарантовати да ће добити дугачке фрагменте за гене са ниском копијом, посебно користећи олиго дТ. Што се тиче 5 'УТР са више ГЦ -а, то је још теже. Стога је још увек разуман метод да се обрне транскрипт насумичним прајмерима, нађу места природног цепања у циљном фрагменту, појачају по сегментима, а затим изврше рестрикциона дигестија и лигација. Генерално, тешко је директно амплификовати фрагменте веће од 2 кб, али није увек немогуће добити: 1. Пре свега, гарантовати интегритет РНК/мРНК, а пожељна је екстракција ТРИЗОЛ -а. 2. М-МЛВ РТ-ПЦР комплет се може директно користити. Продужите време жарења и правилно повећајте број циклуса у процесу појачања. Алтернативно, може се применити угнежђени ПЦР или прво спровести једну или две реакције са одговарајуће продуженим временом денатурације и продужења пре нормалне ПЦР амплификације, што може помоћи у продужењу фрагмената. Обратите пажњу на верност полимеразе. 3. Дуги Так се може користити у ПЦР -у за постизање идеалних резултата. 4. За примену експресије протеина треба применити полимеразу високе верности.

ТИАНГЕН нуди две врсте реверзне транскриптазе: Куант/Кинг РТасе и ТИАНСцрипт М-МЛВ. Главна разлика између њих је улазна количина шаблона. Куант је јединствена реверзна транскриптаза, која се разликује од уобичајено коришћене М-МЛВ изведене из вируса Молонеи мишје леукемије. Куант је нова високо ефикасна реверзна транскриптаза рекомбинантно изражена инжењерингом Есцхерицхиа цоли. Куант је погодан за амплификацију 50 нг-2 μг РНК са високом реверзном транскрипционом активношћу и високим приносом. У поређењу са обичним ММЛВ -ом или АМВ -ом, највећа Куантова карактеристика је да има веома јак афинитет према РНК шаблонима и да може преокренути сложене шаблоне транскрипта без денатурације на високој температури. За шаблоне са већим садржајем ГЦ, обрнута ефикасност је већа. Међутим, ова реверзна транскриптаза има активност РНазе Х, што може утицати на дужину цДНА производа (погодно за шаблоне <4,5 кб). За конвенционалну реверзну транскрипцију препоручује се ТИАНСцрипт ММЛВ реверзна транскриптаза. Ова РТаза је модификовани ензим са врло слабом активношћу РНазе Х, који је погодан за дугу (> 5 кб) синтезу цДНК.

Једностепена реверзна транскрипција и ПЦР амплификација завршавају се у истој епрувети без отварања поклопца цеви између синтезе и амплификације цДНК, што је корисно за смањење контаминације. Пошто се сви добијени узорци цДНК користе за амплификацију, осетљивост је већа, са најмање 0,01 пг укупне РНК. За успешан РТПЦР у једном кораку, генетски специфични прајмери ​​се генерално користе за иницирање синтезе цДНК. Метода у два корака, наиме реверзна транскрипција и ПЦР амплификација, изводи се у два корака. Прво се врши реверзна транскрипција из шаблона РНК да би се добила цДНК, а добијена цДНК се подвргава једној или више различитих ПЦР реакција. Метода у два корака може користити олиго (дТ) или насумичне прајмере за вођење синтезе првог ланца цДНК и може обрнуто транскрибовати све информације мРНА из одређеног узорка.