■ Добра стабилност: Јединствена формула чини читав реакциони систем веома стабилним. Систем садржи компоненте потребне за ефикасну ПЦР амплификацију, као што су термостабилна ДНК полимераза, дНТП, МгЦл2 и пуферски раствор, као и низ посебних стабилизатора, који у великој мери повећавају стабилност полимеразе и дНТП на нормалној температури и 4 ℃.
■ Брзо и једноставно: Једноставно и брзо руковање. Једноставно помешајте две компоненте у пропорцији, а затим додајте шаблоне и прајмере за подешавање реакције, избегавајући досадне кораке додавања различитих ПЦР реакционих компоненти једну по једну. Смањите грешке узорковања и унакрсну контаминацију, са малим грешкама између различитих серија, и могу се користити у полуквантитативним експериментима.
■ Широка примена и висока осетљивост.
■ Сваки реакциони систем садржи боје, а електрофореза се може извести непосредно након ПЦР корака, тако да је поступак брз и штеди рад.
Чистоћа СДС-ПАГЕ је више од 99%; Није откривена активност егзогене нуклеазе; Појединачни ген у људском геному могао би се ефикасно појачати; Нема значајних промена активности ако се чувају на собној температури недељу дана.
Производ који користи двокомпонентни једноставан ПЦР систем може се складиштити на 4 ° Ц месец дана без очигледне промене активности.
Корак 1: Помешајте различите компоненте у пропорцији.
Корак 2: Одмах покрените експеримент.
Корак 3: Директна електрофореза за Мешање са бојама.
Корак 4: Задовољавајући експериментални резултати.
Сви производи се могу прилагодити за ОДМ/ОЕМ. За детаље,кликните Прилагођена услуга (ОДМ/ОЕМ)
![]() |
Примењује се двокомпонентни једноставан ПЦР систем (Голден Еаси ПЦР Систем). Реакциони систем је 50 μл (Ако су реакциони системи различити, пропорционално повећајте или смањите количину реакционих компоненти које се односе на овај систем). |
![]() |
Концентрација финалне реакције |
А-1 Темплате
■ Шаблон садржи протеинске нечистоће или инхибиторе Так, итд. - Очистите шаблон ДНК, уклоните протеинске нечистоће или екстрахујте шаблон ДНК комплетима за пречишћавање.
■ Денатурација шаблона није потпуна —— Одговарајуће повећати температуру денатурације и продужити време денатурације.
■ Деградација шаблона ——Поново припремите шаблон.
А-2 Пример
■ Лош квалитет прајмера —— Поново синтетизујте прајмер.
■ Разградња прајмера —— Поделите прајмере велике концентрације у мале запремине ради очувања. Избегавајте вишеструко замрзавање и одмрзавање или дуготрајно криоконзервирање на 4 ° Ц.
■ Неправилно обликовање прајмера (нпр. Дужина прајмера није довољна, димер формиран између прајмера итд.) -Преизмењавање прајмера (избегавање стварања димера прајмера и секундарне структуре)
А-3 мг2+концентрација
■ Мг2+ концентрација је прениска —— Правилно повећајте Мг2+ концентрација: Оптимизовати Мг2+ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг2+ концентрација за сваки шаблон и прајмер.
А-4 Температура жарења
■ Висока температура жарења утиче на везивање прајмера и шаблона. ——Смањите температуру жарења и оптимизујте стање са градијентом од 2 ° Ц.
А-5 Време продужења
■ Кратко време продужења —— Продужите време продужења.
Феномени: Негативни узорци такође показују траке циљних секвенци.
А-1 Контаминација ПЦР-ом
■ Укрштена контаминација циљне секвенце или продуката амплификације —— Пажљиво да се у негативном узорку не пипетира узорак који садржи циљну секвенцу или да се излије из епрувете за центрифугу. Реагенсе или опрему треба аутоклавирати како би се елиминисале постојеће нуклеинске киселине, а постојање контаминације треба утврдити експериментима са негативном контролом.
■ Контаминација реагенса —— Поразделите реагенсе и чувајте на ниској температури.
А-2 Примеr
■ Мг2+ концентрација је прениска —— Правилно повећајте Мг2+ концентрација: Оптимизовати Мг2+ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг2+ концентрација за сваки шаблон и прајмер.
■ Неправилан дизајн прајмера, а циљна секвенца има хомологију са секвенцом без циља. —— Прајмери за поновно дизајнирање.
Феномени: ПЦР појачавачке траке нису у складу са очекиваном величином, велике или мале, или се понекад јављају и специфичне појачане појасеве и неспецифичне појачане појасеве.
А-1 Пример
■ Лоша специфичност прајмера
—— Прајмер за редизајн.
■ Концентрација прајмера је превисока —— Правилно повећајте температуру денатурације и продужите време денатурације.
А-2 мг2+ концентрација
■ Мг2+ концентрација је превисока —— Правилно смањите концентрацију Мг2+: Оптимизујте Мг2+ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг2+ концентрација за сваки шаблон и прајмер.
А-3 Термостабилна полимераза
■ Превелика количина ензима —— Смањите количину ензима на одговарајући начин у интервалима од 0,5 У.
А-4 Температура жарења
■ Температура жарења је прениска —— Одговарајуће повећајте температуру жарења или усвојите двостепену методу жарења
А-5 ПЦР циклуси
■ Превише циклуса ПЦР -а - Смањите број циклуса ПЦР -а.
А-1 Пример—— Лоша специфичност ——Пројектирајте прајмер, промените положај и дужину прајмера како бисте побољшали његову специфичност; или извршите угнежђену ПЦР.
А-2 ДНК шаблона
—— Шаблон није чист—— Очистите шаблон или извуците ДНК сетовима за пречишћавање.
А-3 мг2+ концентрација
——Мг2+ концентрација је превисока —— Правилно смањити Мг2+ концентрација: Оптимизовати Мг2+ концентрација низом реакција од 1 мМ до 3 мМ са интервалом од 0,5 мМ за одређивање оптималног Мг2+ концентрација за сваки шаблон и прајмер.
А-4 дНТП
—— Концентрација дНТП -а је превисока —— Смањите концентрацију дНТП -а на одговарајући начин
А-5 Температура жарења
—— Прениска температура жарења —— Одговарајуће повећати температуру жарења
Циклуси А-6
—— Превише циклуса ——Оптимизујте број циклуса
Први корак је одабир одговарајуће полимеразе. Обична Так полимераза не може се лекторисати због недостатка 3'-5 'егзонуклеазне активности, а неусклађеност ће у великој мери смањити ефикасност продужења фрагмената. Због тога обична Так полимераза не може ефикасно појачати циљне фрагменте веће од 5 кб. Так полимеразу са посебном модификацијом или другу полимеразу високе верности треба изабрати како би се побољшала ефикасност продужења и задовољиле потребе појачања дугих фрагмената. Осим тога, појачавање дугих фрагмената такође захтева одговарајуће прилагођавање дизајна прајмера, време денатурације, време продужења, пХ пуфера итд. Обично прајмери са 18-24 бп могу довести до бољег приноса. Да би се спречило оштећење шаблона, време денатурације на 94 ° Ц треба смањити на 30 секунди или мање по циклусу, а време за повећање температуре на 94 ° Ц пре појачања треба да буде мање од 1 минута. Штавише, подешавање температуре продужења на око 68 ° Ц и пројектовање времена продужења према брзини од 1 кб/мин може обезбедити ефикасно појачавање дугих фрагмената.
Стопа грешака у амплификацији ПЦР -а може се смањити употребом различитих ДНК полимераза високе верности. Међу свим до сада пронађеним Так ДНК полимеразама, Пфу ензим има најмању стопу грешака и највећу верност (види приложену табелу). Поред селекције ензима, истраживачи могу додатно смањити стопу мутације ПЦР -а оптимизацијом реакционих услова, укључујући оптимизацију састава пуфера, концентрацију термостабилне полимеразе и оптимизацију броја циклуса ПЦР -а.
Наша фабрика од свог оснивања развија производе прве класе поштујући принцип
прво квалитета. Наши производи стекли су одличну репутацију у индустрији и драгоцено поверење међу новим и старим купцима.